Il campionamento dell'acqua per la ricerca di Legionella spp. è una procedura tecnica regolamentata: la norma di riferimento è la UNI EN ISO 11731:2017 (Qualità dell'acqua — Enumerazione di Legionella). Un prelievo eseguito in modo approssimativo — flussaggio prima del prelievo, contenitore non sterile, ritardo nel trasporto — può vanificare anche il migliore laboratorio. Questa guida descrive la procedura corretta per operatori tecnici e responsabili della struttura.
Normativa e standard di riferimento
- UNI EN ISO 11731:2017 — metodo standard per l'enumerazione di Legionella spp. nelle acque.
- Accordo Stato-Regioni 7 maggio 2015 — linee guida per la prevenzione e il controllo della legionellosi (Allegato 2 sul campionamento).
- D.Lgs. 31/2001 e D.Lgs. 18/2023 — qualità delle acque destinate al consumo umano.
- Circolari regionali (Lombardia, Emilia-Romagna, Veneto, Lazio) che specificano modalità integrative di campionamento.
Scelta dei punti di campionamento
I punti non vanno scelti a caso: devono rappresentare i punti a maggior rischio e i punti sentinella dell'impianto. L'Allegato 2 delle linee guida 2015 distingue tra campionamento di sorveglianza routinaria e campionamento in seguito a casi sospetti.
- Punto di ingresso acquedottistico: per valutare il contributo della rete pubblica.
- Ricircolo acqua calda sanitaria (ACS): punto più rappresentativo della circolazione.
- Punti sentinella: ultimo punto d'uso più lontano dalla centrale, spesso al piano più alto o nel ramo più periferico.
- Accumuli (bollitori, serbatoi): prelievo dal rubinetto di drenaggio o dal punto d'uso più prossimo.
- Punti a basso utilizzo: docce di camere raramente occupate, lavabi di servizio, naselli di pronto soccorso.
- Docce ad alta frequenza d'uso: rappresentative del rischio di esposizione degli utenti.
Materiale necessario
- Contenitori sterili da 1 litro con tiosolfato di sodio (neutralizzante del cloro residuo), forniti dal laboratorio accreditato.
- Contenitori aggiuntivi da 1 litro senza neutralizzante per il campione di sedimento (secondo contenitore).
- Termometro a contatto o a infrarossi per la misura della temperatura dell'acqua al momento del prelievo.
- Guanti monouso in nitrile.
- Etichette pre-stampate con codice punto, data, ora, operatore.
- Borsa termica con ghiaccio o gel refrigerante per il trasporto (mantenere 4–10 °C).
- Modulo di accompagnamento campioni (richiesto dal laboratorio).
- Telefono o tablet per fotodocumentazione del punto di prelievo.
Procedura passo per passo
Preparazione del punto di prelievo
Non flussare il punto prima del prelievo. Non disinfettare il rubinetto con alcol o candeggina (modifica la microflora superficiale). Rimuovere eventualmente il rompigetto (aeratore): le linee guida 2015 prevedono sia il campione con rompigetto sia senza, per valutare il biofilm del dispositivo. Annotare lo stato visivo del punto (incrostazioni, rugosità, odore).
Prelievo del primo campione (acqua di rete)
Aprire il rubinetto al massimo flusso, raccogliere direttamente nel contenitore sterile con tiosolfato 1 litro di acqua senza mai toccare l'interno del contenitore o del coperchio. Questo campione rappresenta l'acqua presente nella colonna verticale del rubinetto e nelle tubazioni più prossime. Chiudere immediatamente il contenitore.
Flussaggio e prelievo del secondo campione (sedimento)
Aprire a piena mandata per 2 minuti. Raccogliere il secondo litro nel contenitore senza tiosolfato. Questo campione è arricchito di sedimenti e biofilm staccato dalle pareti delle tubazioni. Chiudere e agitare brevemente per sospendere eventuali particelle. Il secondo campione serve alla ricerca su sedimento oltre che sull'acqua.
Misura della temperatura
Immediatamente dopo il prelievo, misurare la temperatura dell'acqua erogata con il termometro. Annotare sul modulo di accompagnamento. Per i punti ACS e ricircolo, la temperatura è un dato diagnostico fondamentale: valori sotto 50 °C al rubinetto di ricircolo indicano condizioni favorevoli alla moltiplicazione batterica.
Etichettatura e documentazione
Etichettare immediatamente ogni contenitore: codice punto di campionamento (deve corrispondere alla planimetria allegata al DVR), data e ora del prelievo, nome dell'operatore, temperatura rilevata, presenza o assenza di disinfettante residuo. Fotografare il punto di prelievo con l'etichetta visibile per la catena di custodia.
Conservazione a freddo
Inserire immediatamente i contenitori nella borsa termica a 4–10 °C. Non congelare. Evitare l'esposizione diretta alla luce solare. Verificare la temperatura della borsa termica prima di ogni sessione di campionamento: un gel refrigerante esausto invalida i campioni.
Compilazione del modulo di accompagnamento
Completare il modulo fornito dal laboratorio con: numero di campioni, codici, punti di prelievo, temperature, eventuali anomalie riscontrate (odore, colore, incrostazioni), eventuale cloro residuo misurato, condizioni di stoccaggio dell'impianto nelle 48 ore precedenti (interventi, biocidi, variazioni di portata). Firmare il modulo.
Consegna al laboratorio
Consegnare i campioni al laboratorio entro 24 ore dal prelievo, mantenendo la catena del freddo. Oltre le 24 ore il campione non è tecnicamente valido secondo ISO 11731. Se il laboratorio è distante, verificare in anticipo l'orario di accettazione e, per campionamenti su strutture remote, organizzare il corriere dedicato con temperatura monitorata.
Conservazione e trasporto: regole critiche
Il campione biologico è un sistema dinamico: Legionella continua a moltiplicarsi o a morire dopo il prelievo a seconda della temperatura. Una conservazione errata può alterare la carica di 1–2 log in poche ore, rendendo il risultato analitico inaffidabile.
- Temperatura di conservazione: 4–10 °C per tutta la durata del trasporto.
- Tempo massimo: 24 ore dal prelievo all'arrivo in laboratorio.
- No congelamento: danneggia le cellule batteriche e abbassa artificialmente la conta.
- No esposizione solare diretta: il calore accelera la degradazione del campione.
- Registrare la temperatura della borsa termica in partenza e all'arrivo per la catena di custodia.
Errori frequenti che compromettono il campione
- Flussare il rubinetto prima del prelievo del primo campione: altera la carica del punto di prelievo.
- Usare contenitori non forniti dal laboratorio o privi di tiosolfato: il cloro residuo uccide il batterio nel contenitore.
- Non annotare la temperatura dell'acqua al momento del prelievo.
- Consegnare il campione oltre le 24 ore dalla raccolta.
- Congelare i campioni pensando di conservarli meglio.
- Non identificare correttamente il punto sulla planimetria: i dati analitici diventano inutilizzabili.
- Eseguire il campionamento il giorno dopo una disinfezione shock senza comunicarlo al laboratorio.
Checklist operativa campionamento
- Checklist
- Contenitori sterili forniti dal laboratorio, con e senza tiosolfato, in numero sufficiente
- Termometro calibrato disponibile e funzionante
- Borsa termica con gel refrigerante a 4–10 °C
- Planimetria dei punti di campionamento aggiornata
- Moduli di accompagnamento compilati per ogni campione
- Nessun flussaggio preventivo eseguito sul punto (primo campione)
- Temperatura acqua rilevata e annotata immediatamente dopo il prelievo
- Etichette applicate prima di chiudere i contenitori
- Catena del freddo mantenuta dal prelievo alla consegna
- Consegna in laboratorio entro 24 ore dal prelievo
- Fotodocumentazione del punto eseguita
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Prenota il sopralluogo con campionamento inclusoDomande frequenti
- Posso eseguire il campionamento io stesso o serve un tecnico?
- Il campionamento può essere eseguito da personale interno adeguatamente formato, seguendo la procedura ISO 11731 e le istruzioni del laboratorio. Tuttavia, per il primo campionamento di baseline, per le campagne in seguito a positività e per le strutture sanitarie, è preferibile affidarsi al tecnico del laboratorio accreditato che garantisce la corretta identificazione dei punti e la catena di custodia.
- Perché serve un secondo campione di sedimento?
- Legionella colonizza preferenzialmente i biofilm sulle pareti delle tubazioni. Il campione di acqua di rete può dare falso negativo se il biofilm non si è distaccato spontaneamente. Il secondo campione, raccolto dopo flussaggio prolungato, arricchisce il prelievo di particelle di biofilm e aumenta la sensibilità del metodo.
- Cosa significa 'cfu/L' nel referto?
- Cfu/L significa 'colony forming units per litro', ovvero il numero di unità batteriche vitali rilevate per litro d'acqua. Secondo le linee guida 2015, il valore soglia per l'acqua calda sanitaria in strutture ad alto rischio (RSA, ospedali) è <100 cfu/L per uso quotidiano e <1000 cfu/L come soglia di allerta.
- Il laboratorio deve essere accreditato per forza?
- Sì, per le analisi che hanno valore legale e gestionale (sorveglianza, DVR, risposta a positività) il laboratorio deve essere accreditato ACCREDIA per la prova ISO 11731 o equivalente EN. Un laboratorio non accreditato può fornire indicazioni orientative ma i risultati non sono utilizzabili in sede di audit o contenzioso.
- Quanti litri si prelevano per ogni punto?
- Secondo ISO 11731, il volume minimo è 1 litro per la ricerca quantitativa standard. Per la ricerca su sedimento si aggiunge un secondo litro raccolto dopo flussaggio. Alcuni laboratori e protocolli regionali richiedono 2 litri totali per campione (primo e secondo prelievo), per un totale di 2 contenitori per punto.
- Cosa fare se il campione si scalda durante il trasporto?
- Se la temperatura ha superato i 10 °C in modo prolungato durante il trasporto, comunicarlo al laboratorio al momento della consegna. Il laboratorio valuterà la validità del campione: in caso di dubbio, il campionamento va ripetuto. Non consegnare mai campioni di cui si sospetta la compromissione senza segnalarlo.