In questo articolo
- 01Storia e ambito di applicazione
- 02Principio del metodo: coltura su BCYE + GVPC
- 03BCYE: il "terreno base"
- 04GVPC: il terreno selettivo
- 05Aerobiosi + 2,5% CO₂, 36 ± 1 °C
- 06I trattamenti pre-coltura: acido, calore, filtrazione
- 071. Filtrazione su membrana 0,22-0,45 µm
- 082. Trattamento acido (pH 2,2)
- 093. Trattamento termico (50 °C × 30 min)
- 10Step operativo del laboratorio: dalla bottiglia al referto
- 11Limite di rilevazione e di quantificazione
- 12Incertezza di misura ed espressione del risultato
- 13Conferma e tipizzazione
- 14Norme tecniche collegate
- 15UNI EN ISO 11731:2017 vs ISO/TS 12869:2019 (qPCR): quando si usano
- 16Implicazioni per i gestori di struttura
- 17FAQ — UNI EN ISO 11731:2017
- 18La UNI EN ISO 11731:2017 è obbligatoria per legge?
- 19Posso usare solo la qPCR (ISO/TS 12869:2019) al posto della coltura?
- 20Perché il referto arriva dopo 10 giorni?
- 21Cosa significa "limite di quantificazione 50-100 UFC/L"?
- 22L'incertezza di misura è un difetto del laboratorio?
- 23Come verifico se un laboratorio applica davvero la UNI EN ISO 11731:2017?
- 24La norma si applica anche ai tamponi su biofilm?
- 25Cosa cambia se la mia ASL chiede solo "Legionella" senza specificare la norma?
- 26Vuoi essere sicuro che il tuo prossimo referto sia UNI EN ISO 11731:2017?
La UNI EN ISO 11731:2017 è la norma tecnica internazionale che definisce il metodo di riferimento per l'enumerazione quantitativa di Legionella spp. in campioni d'acqua. Pubblicata in versione italiana nel 2017, ha sostituito ISO 11731:1998 e ISO 11731-2:2004 e oggi è la base su cui i laboratori accreditati ISO/IEC 17025 fondano i rapporti di prova accettati dall'Accordo Stato-Regioni 7/5/2015. Definisce terreni selettivi, trattamenti pre-coltura, tempi e temperature di incubazione, limite di quantificazione e modalità di espressione dei risultati in UFC/L.
TL;DR — Risposta in 50 parole
Metodo colturale su terreno selettivo GVPC + BCYE. Filtrazione 1 L → decontaminazione acida + termica → inoculo → incubazione 36 ± 1 °C, 7-10 giorni in aerobiosi + 2,5% CO₂. Limite di quantificazione 50-100 UFC/L (filtrazione 1 L). Conferma per assenza di crescita su BCYE privo di L-cisteina. Tipizzazione finale per agglutinazione al lattice.
Storia e ambito di applicazione #
La famiglia delle norme ISO 11731 ha tre tappe:
- ISO 11731:1998 — prima versione, metodo colturale di base.
- ISO 11731-2:2004 — estensione per campioni con bassa contaminazione (filtrazione su membrana, concentrazione).
- ISO 11731:2017 — versione consolidata, unifica le due precedenti e integra trattamenti pre-coltura aggiornati. Recepita in Italia come UNI EN ISO 11731:2017 [fonte: UNI, catalogo norme].
Ambito di applicazione: enumerazione di Legionella spp. in tutti i tipi di acqua rilevanti per la salute pubblica, in particolare:
- acqua potabile e di rete (ACS, AFS);
- acque di torri di raffreddamento e condensatori evaporativi;
- acque di vasche idromassaggio, piscine, terme;
- acque di processo industriale e impianti di climatizzazione con umidificazione;
- biofilm di superfici a contatto con acqua (con limitazioni dichiarate).
La norma non si applica direttamente ai campioni clinici (espettorato, BAL): per quelli si usano CIM, immunofluorescenza diretta, qPCR specifica e antigene urinario, secondo linee guida ESCMID/ESGLI.
Per il quadro normativo nazionale che la richiama, vedi anche Accordo Stato-Regioni 2015 e D.Lgs 81/08 e legionella.
Principio del metodo: coltura su BCYE + GVPC #
Il principio della UNI EN ISO 11731:2017 è il metodo colturale quantitativo su terreni selettivi.
BCYE: il "terreno base" #
Il BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) è il terreno non selettivo di riferimento per Legionella. Contiene:
- estratto di lievito (azoto e fattori di crescita);
- carbone attivo (assorbe metaboliti tossici prodotti durante l'autoclavaggio);
- L-cisteina e ferro pirofosfato (fattori obbligati per Legionella);
- tampone ACES a pH 6,9.
La caratteristica distintiva è la dipendenza dalla L-cisteina: Legionella spp. cresce su BCYE ma non cresce su un terreno BCYE privo di L-cisteina (BCYE-cys). Questo è il test di conferma essenziale: una colonia sospetta che cresce su BCYE e non cresce su BCYE-cys è Legionella confermata.
GVPC: il terreno selettivo #
Il GVPC (Glycine Vancomicina Polimixina Cicloeximide) è il BCYE + miscela di antibiotici che inibisce la crescita della flora competitrice (batteri Gram+, Gram-, lieviti, muffe):
- glicina: inibisce Gram+;
- vancomicina: inibisce Gram+;
- polimixina B: inibisce Gram-;
- cicloeximide: inibisce funghi e lieviti.
GVPC è il terreno selettivo principale per il monitoraggio ambientale di routine. La norma consente anche MWY (Modified Wadowsky-Yee) per campioni particolarmente sporchi.
Aerobiosi + 2,5% CO₂, 36 ± 1 °C #
L'incubazione avviene a 36 ± 1 °C in atmosfera umidificata con 2,5% CO₂. Tempi minimi: 7 giorni; tempi massimi: 10 giorni. Le piastre vengono lette ogni 48-72 ore per individuare le colonie tipiche (sezione 8 della norma).
I trattamenti pre-coltura: acido, calore, filtrazione #
La UNI EN ISO 11731:2017 prevede tre trattamenti pre-coltura che migliorano il recupero di Legionella sopprimendo la flora competitrice ed estraendo le cellule dal biofilm:
1. Filtrazione su membrana 0,22-0,45 µm #
Per campioni con bassa contaminazione attesa (acqua potabile, ACS pulite), si filtra 1 litro di campione su membrana 0,22 µm policarbonato o 0,45 µm cellulosa. La membrana viene poi risospesa in 5-10 mL di acqua sterile e inoculata sulle piastre. Questo aumenta il fattore di concentrazione di 100-200×, abbassando il limite di quantificazione a 50 UFC/L.
2. Trattamento acido (pH 2,2) #
Sospensione del campione concentrato in tampone HCl-KCl pH 2,2 per 5 minuti a temperatura ambiente. Inibisce drasticamente Gram-positivi e Gram-negativi non-Legionella. Legionella, batterio Gram-negativo "atipico", sopravvive grazie alla struttura della membrana esterna.
3. Trattamento termico (50 °C × 30 min) #
Sospensione del campione a 50 °C per 30 minuti. Legionella è termo-resistente fino a 55 °C; molte altre specie ambientali sono inattivate. Trattamento usato in combinazione con quello acido per la massima selettività.
I trattamenti possono essere applicati separatamente o in combinazione secondo il tipo di matrice. La norma prevede uno schema decisionale (Annex A) che guida la scelta in funzione di torbidità, presenza di flora competitrice attesa e tipo di acqua.
Step operativo del laboratorio: dalla bottiglia al referto #
| Step | Cosa fa il laboratorio | Tempo |
|---|---|---|
| 1 | Ricezione campione, verifica catena di custodia, temperatura (4-8 °C) | 0 h |
| 2 | Filtrazione 1 L su membrana 0,22 µm + risospensione in 10 mL | 30-60 min |
| 3 | Aliquotazione per trattamenti (tal quale, acido, termico) | 15 min |
| 4 | Trattamento acido pH 2,2 × 5 min OPPURE termico 50 °C × 30 min | 5-30 min |
| 5 | Inoculo su BCYE + GVPC (3 piastre × trattamento) | 15 min |
| 6 | Incubazione 36 ± 1 °C, 2,5% CO₂ | 7-10 giorni |
| 7 | Lettura piastre a 48h, 72h, 5g, 7g, 10g | 7-10 giorni |
| 8 | Conferma colonia su BCYE-cys (test cisteina) | 24-48 h |
| 9 | Tipizzazione (se richiesta) per agglutinazione al lattice | < 30 min |
| 10 | Stesura rapporto di prova ACCREDIA con UFC/L, specie, sierogruppo | 24 h |
Tempo totale tipico: 10-12 giorni dal prelievo al referto. Per i dettagli del prelievo a monte, vedi Frequenza campionamenti legionella e i protocolli che applichiamo nei singoli settori (hotel, RSA, palestre e SPA).
Limite di rilevazione e di quantificazione #
La UNI EN ISO 11731:2017 distingue:
- Limite di rilevazione (LOD): la minima carica che permette di concludere "presente"/"assente" con la procedura. Con filtrazione 1 L, il LOD operativo è 50 UFC/L (1 colonia / 100 mL di concentrato).
- Limite di quantificazione (LOQ): la minima carica che permette una stima numerica affidabile. Tipicamente 100 UFC/L.
Per ottenere un LOQ inferiore (es. 10 UFC/L), si può filtrare volumi maggiori (5-10 L) con membrane multiple — utilizzato in indagini outbreak o post-bonifica.
Espressione dei risultati: la norma chiede l'espressione in UFC/L (Unità Formanti Colonia per litro) con specie/sierogruppo se identificata, e — quando applicabile — l'incertezza estesa del metodo (vedi sezione successiva).
Per la lettura della soglia in funzione del tipo di struttura, vedi Soglie UFC/L legionella.
Incertezza di misura ed espressione del risultato #
L'ISO/IEC 17025:2017 impone ai laboratori accreditati di dichiarare l'incertezza estesa di misura (U, k=2, livello di confidenza ~95%) su ogni rapporto di prova. Per il metodo colturale UNI EN ISO 11731:2017, la fonte principale di incertezza è la variabilità di conteggio delle colonie, descritta dalla distribuzione di Poisson.
In pratica:
- Conteggio < 10 colonie: l'incertezza relativa supera il 30%, va dichiarata o si esprime il risultato come "stima" (Annex C).
- Conteggio 10-100 colonie: incertezza relativa 15-30%.
- Conteggio > 100 colonie: incertezza ~10-15%.
A questo si aggiungono fonti sistemiche (variabilità inter-operatore, ripetibilità intra-laboratorio, recupero dei trattamenti pre-coltura), tipicamente quantificate dal laboratorio nel proprio bilancio di incertezza ai sensi della Guida ISO/IEC 98-3 (GUM).
Un rapporto di prova ACCREDIA serio mostra:
- valore puntuale UFC/L;
- incertezza estesa (es. "2.400 ± 480 UFC/L, k=2");
- metodo di riferimento (UNI EN ISO 11731:2017);
- numero di accreditamento del laboratorio;
- catena di custodia documentata.
Diffida dei rapporti che mostrano solo il valore puntuale senza incertezza: è un indicatore di laboratorio non accreditato o di rapporto fuori scopo di accreditamento.
Conferma e tipizzazione #
La UNI EN ISO 11731:2017 prevede due livelli di conferma:
- Conferma di Legionella spp.: la colonia sospetta deve crescere su BCYE e non crescere su BCYE privo di L-cisteina. Questo conferma l'appartenenza al genere.
- Identificazione di specie e sierogruppo (opzionale ma sempre raccomandata): tipicamente per agglutinazione al lattice con kit monoclonali che separano L. pneumophila SG1, L. pneumophila SG2-15, Legionella spp. non-pneumophila.
Per livelli di risoluzione superiori (es. confronto con isolato clinico in indagini outbreak), si usano:
- immunofluorescenza diretta (DFA): separa SG1-15 singoli;
- PCR specie-specifica e mip-gene sequencing: identificazione di specie ad alta confidenza;
- Sequencing-Based Typing (SBT): ottiene il Sequence Type confrontabile internazionalmente con ELDSNet.
Per il dettaglio metodologico e i prezzi della tipizzazione vedi Tipizzazione Legionella pneumophila.
Norme tecniche collegate #
UNI EN ISO 11731:2017 si applica nel quadro di un sistema di norme complementari:
| Norma | Ambito | Stato |
|---|---|---|
| ISO 19458:2006 | Campionamento di acque per analisi microbiologiche (conservazione 4 °C, trasporto entro 24h) | Vigente |
| ISO/TS 12869:2019 | qPCR per Legionella spp. e L. pneumophila | Vigente |
| ISO/IEC 17025:2017 | Requisiti per i laboratori di prova e taratura (accreditamento ACCREDIA) | Vigente |
| ISO/IEC Guide 98-3 (GUM) | Espressione dell'incertezza di misura | Vigente |
| UNI 11623 | Linea guida per torri evaporative e condensatori (campionamento e gestione) | Vigente |
Per il confronto operativo coltura vs qPCR, vedi anche Tempi analisi legionella e gli articoli del nostro blog dedicati ai metodi.
UNI EN ISO 11731:2017 vs ISO/TS 12869:2019 (qPCR): quando si usano #
| Caratteristica | UNI EN ISO 11731:2017 (coltura) | ISO/TS 12869:2019 (qPCR) |
|---|---|---|
| Tempi risultato | 7-10 giorni | 24-48 ore |
| Quantificazione | UFC/L (cellule vitali) | GU/L (Genome Units) — include cellule morte |
| Limite quantificazione | 50-100 UFC/L | 100-1.000 GU/L (dipende dal kit) |
| Selettività | Alta (trattamenti pre-coltura) | Alta (primer specifici) |
| Riconoscimento Accordo SR 2015 | Riferimento | Complemento (non ammessa come unico metodo per il controllo) |
| Idoneità a indagine giudiziale | Sì | Limitata |
| Costo medio Italia 2026 | 50-90 €/campione | 70-130 €/campione |
| Quando usarla | Sorveglianza ordinaria, post-bonifica, casi sentinella | Screening rapido, post-bonifica immediata, emergenze |
La regola operativa: coltura è obbligatoria per la valutazione del rischio e l'autocontrollo previsti dall'Accordo SR 2015; qPCR è strumento di integrazione per emergenze o screening rapidi.
Implicazioni per i gestori di struttura #
Per chi non è un microbiologo, le cose da ricordare della UNI EN ISO 11731:2017 sono:
- Il referto che ti consegna il laboratorio deve riportare esplicitamente "Metodo: UNI EN ISO 11731:2017" — è la prova che il dato è accettato dall'Accordo SR 2015.
- I tempi standard sono 10-12 giorni: non è una "lentezza" del laboratorio, è la biologia di Legionella.
- L'incertezza di misura dichiarata sul referto non è un difetto: è la prova che il laboratorio è ACCREDIA.
- La filtrazione 1 L è il minimo: campioni < 1 L non sono validi per il metodo standard.
- Conservazione 4 °C entro 24 h dal prelievo: oltre, il campione si modifica e il dato perde valore [fonte: ISO 19458:2006].
- Per cluster, post-bonifica con tempi stretti e indagini ASL, qPCR è un complemento, non un sostituto.
Per la dimensione economica della scelta di un laboratorio accreditato vedi Costo analisi legionella 2026; per il quadro a Milano/Roma le pagine Milano 2026 e Roma 2026; per i casi pratici i Casi studio 2024-2025. Per i settori il quadro è in /settori.
FAQ — UNI EN ISO 11731:2017 #
La UNI EN ISO 11731:2017 è obbligatoria per legge? #
L'Accordo Stato-Regioni 7/5/2015 indica la coltura come metodo di riferimento per la valutazione del rischio e l'autocontrollo. UNI EN ISO 11731:2017 è lo standard tecnico che operativizza quella indicazione. I rapporti di prova non riconducibili a questa norma (o predecessori superati) sono non accettati dalle ATS/ASL nelle ispezioni.
Posso usare solo la qPCR (ISO/TS 12869:2019) al posto della coltura? #
No, non come unico metodo per gli obblighi dell'Accordo SR 2015. La qPCR rileva anche DNA di cellule non vitali, quindi può sovrastimare il rischio reale; la coltura misura le cellule vitali e coltivabili. Vedi confronto in Tempi analisi legionella.
Perché il referto arriva dopo 10 giorni? #
Perché Legionella è un batterio a crescita lenta: la norma prevede incubazione fino a 10 giorni a 36 °C prima di refertare. Tempi inferiori (es. 3-5 giorni) falserebbero il risultato per difetto.
Cosa significa "limite di quantificazione 50-100 UFC/L"? #
Significa che con il metodo standard (filtrazione 1 L) il laboratorio può distinguere "presente in concentrazione 50-100 UFC/L o superiore" con precisione accettabile. Sotto questi valori il risultato è espresso come "< 50 UFC/L" o "non rilevato".
L'incertezza di misura è un difetto del laboratorio? #
No, è un requisito normativo dell'ISO/IEC 17025:2017. L'incertezza descrive la variabilità intrinseca del conteggio colonie e del processo di laboratorio. Un referto senza incertezza è meno trasparente, non più preciso.
Come verifico se un laboratorio applica davvero la UNI EN ISO 11731:2017? #
Tre passaggi: (1) chiedi il certificato di accreditamento ACCREDIA (numero di accreditamento), (2) verifica sulla banca dati pubblica accredia.it lo scope (deve includere "Legionella spp. — UNI EN ISO 11731:2017"), (3) leggi il rapporto di prova: deve citare la norma esplicitamente.
La norma si applica anche ai tamponi su biofilm? #
La UNI EN ISO 11731:2017 prevede il prelievo da acqua. Per biofilm su soffioni e rompigetto si usano tamponi sterili secondo procedure di laboratorio standardizzate, generalmente come complemento all'analisi dell'acqua per indagini approfondite (vedi gli articoli sui protocolli operativi).
Cosa cambia se la mia ASL chiede solo "Legionella" senza specificare la norma? #
Anche se l'ASL non la cita esplicitamente, il rapporto di prova che presenti deve essere riconducibile a UNI EN ISO 11731:2017 per essere opponibile in caso di contestazione. È un dettaglio che diventa critico in caso di contenzioso (vedi giurisprudenza richiamata in D.Lgs 81/08 e legionella).
Vuoi essere sicuro che il tuo prossimo referto sia UNI EN ISO 11731:2017? #
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Team 123legionella
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